На главную ДЛЯ НОВИЧКОВДЛЯ НОВИЧКОВ СОБЫТИЯ КАРТА САЙТА ПРЕСС-СЛУЖБА
ДЛЯ СПЕЦИАЛИСТОВДЛЯ СПЕЦИАЛИСТОВ ДАТЫ ПОЛЕЗНЫЕ ССЫЛКИ О ПРОЕКТЕ
ДЛЯ ИНВЕСТОРОВДЛЯ ИНВЕСТОРОВ КОМПАНИИ ГОСТЕВАЯ НАГРАДЫ
SWITCH TO ENGLISH СТАТЬИСТАТЬИ БАЗА ДАННЫХ ФОРУМ КОНТАКТЫ
поиск по сайту  
подписка  


Биотерроризм

Биокомпьютеры

С-пептид. Часть III.

С-пептид. Часть II

С-пептид. Часть I.

Инсулин. Часть II.

Инсулин. Часть I.

Атипичная пневмония. Часть II.

Атипичная пневмония. Часть I.

Геносистематика - что это такое Часть 2.

ДНК или РНК: кто более матери-Природе ценен?

Будущее коммерческого внедрения генетически модифицированных организмов в странах европейского союза

Простая модель реакции организма на внешние воздействия

Некоторые современные подходы к терапии болезни Альцгеймера

Болезнь Альцгеймера. Молекулярно-биологический аспект. Часть II

Болезнь Альцгеймера. Молекулярно-биологический аспект. Часть I

Болезнь Альцгеймера. От описания симптомов - к молекулярным механизмам.

Главный комплекс тканевой совместимости человека (HLA). Часть 5

Главный комплекс тканевой совместимости человека (HLA). Часть 3

Главный комплекс тканевой совместимости человека (HLA). Часть 2

Главный комплекс тканевой совместимости человека (HLA). Часть 1

«Страшная» еда

Эглин

Почему философия не удовлетворяет биолога?

Инвестиционная привлекательность Российского рынка биоинформатики и биотехнологий

Геносистематика - что это такое.

Эндотоксины Bacillus thuringiensis

Диабет. (часть II)

Вешенка и человек

Диабет. (часть I)

Почему ограничены размеры бактериальной колонии?

Функциональная роль остеопонтина в развитии и реконструкции костной ткани.

Структура и некоторые свойства белка остеопонтина.

Проблемы инвестирования в биотехнологические разработки для сельского хозяйства.

Роль метилирования ДНК в канцерогенезе.

Жизнь и смерть овечки Долли

Дню борьбы с проказой посвящается...

Бактерии, приносящие миллиард.

Дню борьбы со СПИДом - достойные проводы!

Современная лаборатория молекулярной биологии.

Интервью с вампирчиком.


Наши статьи

С-пептид. Часть III.

Микробиологическое получение С-пептида

В предыдущих статьях этой серии были подробно рассмотрены биологические и физико-химические свойства С-пептида, его биосинтез в организме человека. Как уже говорилось выше, ряд методов производства инсулина основан на получении данного гормона в виде предшественника (проинсулина) с последующим ферментативным расщеплением до инсулина и С-пептида. Причем, учитывая важность инсулина для современной медицины, в данном случае С-пептид является "побочным" продуктом. Кроме этого, прежде чем приступить к рассмотрению способов получения очищенного С-пептида, хотелось бы обратить внимание читателей на то, что разные авторы (и производители тоже) до сих пор "не договорились" что же считать С-пептидом. Существует три "варианта" С-пептида. "Первый вариант" (самый длинный) - та последовательность, которой отличается проинсулин от инсулина, то есть С-пептид, фланкированный с двух сторон катионными парами. "Второй" - С-пептид с одной катионной парой на С-конце (продукт протеолиза проинсулина трипсином) и "третий" (самый короткий) С-пептид без катионных пар.

На мой взгляд, С-пептидом следует называть последний вариант потому, что катионная пара, которая отщепляется от С-конца В-цепи инсулина в процессе созревания гормона аналогична катионной паре на С-конце С-пептида и тоже узнается экзопротеолитическими ферментами (например, кабоксипептидазой В). Следовательно, при биосинтезе С-пептида образуется именно "третий вариант". После этого "уточнения" можно приступать к повествованию о микробиологических способах получения С-пептида.

Совместное с инсулином.

При данном способе генно-инженерные С-пептид и инсулин образуется в ходе ферментативного расщепления трипсином и карбоксипептидазой В [1, 2] проинсулина человека который, в свою очередь, получают из гибридного белка, выделяемого из разрушенных клеток рекомбинантных штаммов E. coli. В данной работе [3] авторы использовали штамм JM 109 N1864 (Государственная коллекция ВНИИА) со встроенной в плазмиду нуклеотидной последовательностью экспрессирующей гибридный белок, который состоит из линейного проинсулина и присоединенного к N-концу через остаток метионина фрагмента белка А Staphylococcus aureus. Культивирование насыщенной биомассы рекомбинантных клеток обеспечивает начало производства гибридного белка, выделение и последовательная трансформация которого приводят к получению конечных продуктов (С-пептида и инсулина). Другая группа исследователей [4] получала в бактериальной системе экспрессии слитый рекомбинантный белок, состоящий из проинсулина человека и присоединенного к нему через остаток метионина полигистидинового "хвоста". Его выделяли используя хелатную хроматографию на колонках с Ni-агарозой [5] из телец включения и расщепляли бромцианом. Авторы определили, что выделенный белок является S-сульфонированным. Картрирование и масс-спектрометрический анализ полученного проинсулина, очищенного ионообменной хроматографией на анионите и ОФ ВЭЖХ, показали наличие дисульфидных мостиков, соответствующих дисульфидным мостикам нативного проинсулина человека. Позднее, в работе [6] была описана упрощенная процедура выделения проинсулина, полученного по аналогичной схеме, с использованием только ОФ ВЭЖХ. В работе [7] сообщается о разработке нового, усовершенствованного способа получения инсулина человека методами генной инженерии в прокариотических клетках. Авторами установлено, что полученный инсулин по своему строению и биологической активности идентичен гормону, выделенному из поджелудочной железы. В последнее время пристальное внимание уделяется упрощению процедуры получения рекомбинантного инсулина методами генной инженерии. Так в работе [8] авторы получили слитой белок, состоящий из лидерного пептида интерлейкина 2 присоединенного к N-концу проинсулина, через остаток лизина. Белок эффективно экспрессировался и локализовался в тельцах включения. После выделения белок расщеплялся трипсином с получением инсулина и С-пептида. Другая группа исследователей [9] действовала аналогичным способом. Слитый белок из проинсулина и двух синтетических доменов, связывающих IgG, полученных на основе белка А стафилококков локализовался в тельцах включения, но обладал более высоким уровнем экспрессии. Белок выделялся аффинной хроматографией с использованием IgG и обрабатывался трипсином и карбоксипептидазой В. Полученные инсулин и С-пептид очищались ОФ ВЭЖХ.

В работе [10] описано получение мутанта проинсулина, который содержал замену Arg32Tyr. При совместном расщеплении этого белка трипсином и карбоксипептидазой В образовывался нативный инсулин и С-пептид содержащий остаток тирозина. Последний после мечения 125I активно используется в радиоиммунном анализе. Полипептиды, предназначенный для изготовления лекарственных препаратов, должны быть высокой чистоты. Поэтому необходим высокоэффективный контроль за чистотой получаемых продуктов на каждой стадии производства. Ранее с помощью ОФ и ИО ВЭЖХ были охарактеризованы проинсулин-S-сульфонат, проинсулин, отдельные А- и В-цепи и их S-сульфонаты [11], также особое внимание уделялось флуоресцентным производным инсулина [12]. В работе [3] авторы исследовали применимость и информативность хроматографических методов при анализе продуктов всех стадий производства инсулина человека и составили регламент хроматографических операций позволяющий эффективно разделять и охарактеризовывать полученные продукты. Авторы [13] разделяли производные инсулина используя бифункциональные сорбенты (гидрофобная и ионообменная ОФ ВЭЖХ) и показали возможность управления селективностью разделения варьируя вклад каждого из взаимодействий, благодаря чему достигается большая эффективность при разделении близких аналогов белка. Кроме того, разрабатываются подходы для автоматизации и ускорения процессов определения чистоты и количества конечных продуктов.

Индивидуальное (в составе слитых белков)

При создании слитых конструкций весьма существенным является соотношение молекулярных масс белка носителя и целевого полипептида. Так в работе [14] описано конструирование слитых конструкций, где в качестве белка носителя использовали белок, связывающий сывороточный альбумин человека, к которому присоединяли один, три и семь С-пептидов с остатком тирозина на N-конце. С-пептиды соединялись по принципу "голова-хвост" с помощью аминокислотных спейсеров, несущих сайт рестрикции Sfi I и два аргинина в начале и в конце спейсера для последующего расщепления слитого белка трипсином. Слитые белки локализовались преимущественно в цитоплазме и имели схожие уровни накопления (около 50 мг на литр ночной культуры). ВЭЖХ продуктов расщепления этих трех слитых белков показала, что отщепление С-пептида проходит количественно. Это позволяет использовать способ мультимерных синтетических генов для получения целевых полипептидов в промышленном масштабе.

Та же группа авторов [15] получила высокоэффективный штамм-продуцент слитого белка, содержащего в своем составе семь С-пептидов на основе штамма Escherichia coli О17. Уровень накопления слитого белка в цитоплазме составил 1.8 г на литр ночной культуры. Разработанная технология получения С-пептида включала в себя преципитацию нуклеиновых кислот после лизиса клеток с последующим выделением слитого белка ионообменной хроматографией на Q Sepharose FF (анионит). Затем очищенный слитой белок подвергали протеолизу трипсином и разделяли продукты расщепления ОФ ВЭЖХ и гель-фильтрацией. Данный метод позволил получить 400 мг С-пептида (чистота 95 %).

Проблемы и недостатки.

Несмотря на многообразие методов получения С-пептида проинсулина человека все они обладают рядом существенных недостатков. Так, целая группа методов получения С-пептида совместно с инсулином основана на микробиологическом синтезе полипептидных конструкций (несущих в своем составе проинсулин и некоторую аффинную часть), которые локализуются в тельцах включения в нерастворимом виде. Выделение таких белков влечет за собой ряд технологических затруднений, связанных с переводом подобных полипептидов в растворимое состояние. Для упрощения процедуры выделения С-пептида целесообразно создание высокоэффективных штаммов-продуцентов белков (несущих в своем составе проинсулин человека), которые находились бы в клетках в растворимом виде. Одним из решений этой проблемы может стать создание генноинженерных конструкций на основе белков-носителей (например, стрептавидина), продукты которых экспрессируются в периплазматическом пространстве клеток в растворимом виде.

Кроме этого, с точки зрения технологической эффективности методы получения С-пептида совместно с инсулином являются невыгодными из-за низкого выхода целевого пептида (С-пептида). Существенно повысить выход целевого пептида позволяют методы индивидуального получения С-пептида, в составе слитых белков. При создании подобных конструкций целесообразно использовать принцип мультимерности целевого пептида [14, 15], то есть генноинженерных конструкций, в которых к аффинной компоненте последовательно присоединено некоторое количество мономеров С-пептида по принципу "голова-хвост". Кроме этого, аминокислотная последовательность С-пептида (последние две С-концевые аминокислоты Lys-Arg являются катионной парой, узнающейся трипсином) позволяет провести подобное конструирование без использования аминокислотных спейсеров между С-пептидами.

Еще одним преимуществом способа получения С-пептида в виде слитой генноинженерной конструкции с белком-носителем (по сравнению со способами получения С-пептида совместно с инсулином) является отсутствие в технологическом цикле стадии обработки продуктов протеолиза трипсином карбоксипептидазой В - достаточно дорогого фермента.

Таким образом, существуют все предпосылки для микробиологического получения С-пептида не только совместно с инсулином, но и индивидуально. Однако большинство компаний до сих пор продают препараты С-пептида, полученные в результате химического синтеза. Возможно, что такое положение вещей объясняется теми недостатками микробиологического получения С-пептида, которым посвящена последняя часть статьи.


Список цитируемой литературы:

1. Протеолиз проинсулина человека, катализируемый нативным, модифицированным и иммобилизованным трипсином. / Миргородская О.А., Казанина Г.А., Миргородская Е.П., Шевченко А.А., Мальцев К.В., Мирошников А.И., Ройпсторфф П. // Биоорганическая Химия, 1997 - 23, № 2 стр. 91 - 97.
2. Иммобилизация трипсина и карбоксипептидазы В на модифицированных кремнеземах и их применение в превращении рекомбинантного проинсулина человека в инсулин. / Кудрявцева Н.Е., Жигис Л.С., Зубов В.П., Вульфсон А.И., Мальцев К.В., Румш Л.Д. // Хим.-фармац. ж., 1995 - 29, № 1 стр. 61 - 64.
3. Генно-инженерный инсулин человека. ВЭЖХ в анализе продуктов основных стадий производства./ Клюшниченко В. Е., Акимов С. А., Мальцев К. В., Арутюнян А. М., Иванов А. Е., Вульфсон А. Н.// Биоорганическая химия, 1992 - 18, № 12 стр. 1478-1486.
4. Expression, purification and characterization of recombinant human proinsulin. / Cowley D. J., Mackin R. B. // FEBS Lett., 1997 - 402, № 2-3 стр. 124 - 130.
5. Fusion tails for the recovery and purification of recombinant proteins. / Ford C.F., Suominen I., Glatz C.E. // Protein Expr. Purif., 1991 - 2, № 2-3, стp. 95-107.
6. Streamlined procedure for the production of normal and altered Versions of recombinant human proinsulin./ Mackin R.B. // Protein Expr Purif 1999 - 15 стр. 308-313.
7. Generation of human insulin: Заявка WO 96/20724 междунар. РСТ, МКИ6 A61K 38/28, C12N 15/17 / Hartman J., Mendelovitz S., Goresku M., Bio-Technology General Corp. - № 94/13268; Заявл 29.12.94; Опубл 11.7.96.
8. Expression and folding of an interleukin-2-proinsulin fusion protein and its conversion into insulin by a single step enzymatic removal of the C-peptide and the N-terminal fused sequence. / Castellanos-Serra L.R., Hardy E., Ubieta R., Vispo N.S., Fernandez C., Besada V., Falcon V., Gonzalez M., Santos A., Perez G., Silva A., Herrera L. // FEBS Lett., 1996 - 378, № 2 стр. 171 - 176.
9. Integrated production of human insulin and its C-peptide. / Nilsson J., Jonasson P., Samuelsson E., Stahl S., Uhlen M. // J. Biotechnol., 1996 - 48, № 3 стр. 241 - 250.
10. Preparation of Tyr-C-peptide from genetically altered human insulin precurssor. / Sun H., Tang J., Hu M. // Appl. Biochem. Biotechnol., 1995 - 55, № 3 стр. 167 - 174.
11. Coordinative interactions in the separation of insulin and its derivatives by high-performance liquid chromatography./ Peter A., Szepesi G., Balaspiri L., Burger K.// J. Chromatogr., 1987 - 408 стр. 43-52.
12. Высокоэффективная жидкостная хроматография флуоресцентных производных инсулина. / Петроченко Е.В., Киселев П.А. // Биоорганическая Химия, 1996 - 22, № 3 стр. 175 - 179.
13. Генно-инженерный инсулин человека. Повышение эффективности хроматографического разделения при использовании принципа бифункциональности. / Романчиков А.Б., Якимов С.А., Клюшниченко В.Е., Арутунян А.М., Вульфсон А.Н. // Биоограническая Химия, 1997 - 23, № 2 стр 98 - 103.
14. Gene fragment polymerization gives increased yields of recombinant human proinsulin C-peptide. / Jonasson P., Nygren P.A., Johansson B.L., Wahren J., Uhlen M., Stahl S. // Gene, 1998 - 210, № 2 стр. 203 - 210.
15. Integrated bioprocess for production of human proinsulin C-peptide via heat release of an intracellular heptameric fusion protein./ Jonasson P., Nygren P.-A., Jornvall H., Johansson B.-L., Wahren J., Uhlen M., Stahl S.// J. Biotechnol., 2000 - 76, стр. 215 - 226



Rusbiotech™
Copyright © 2000-2003 Rusbiotech
designed by Интерруссофт © 2003





   Яндекс цитирования    ЧИСТЫЙ ИНТЕРНЕТ - www.logoSlovo.RU   TopList