На главную ДЛЯ НОВИЧКОВДЛЯ НОВИЧКОВ СОБЫТИЯ КАРТА САЙТА ПРЕСС-СЛУЖБА
ДЛЯ СПЕЦИАЛИСТОВДЛЯ СПЕЦИАЛИСТОВ ДАТЫ ПОЛЕЗНЫЕ ССЫЛКИ О ПРОЕКТЕ
ДЛЯ ИНВЕСТОРОВДЛЯ ИНВЕСТОРОВ КОМПАНИИ ГОСТЕВАЯ НАГРАДЫ
SWITCH TO ENGLISH СТАТЬИСТАТЬИ БАЗА ДАННЫХ ФОРУМ КОНТАКТЫ
поиск по сайту  
подписка  


Биотерроризм

Биокомпьютеры

С-пептид. Часть III.

С-пептид. Часть II

С-пептид. Часть I.

Инсулин. Часть II.

Инсулин. Часть I.

Атипичная пневмония. Часть II.

Атипичная пневмония. Часть I.

Геносистематика - что это такое Часть 2.

ДНК или РНК: кто более матери-Природе ценен?

Будущее коммерческого внедрения генетически модифицированных организмов в странах европейского союза

Простая модель реакции организма на внешние воздействия

Некоторые современные подходы к терапии болезни Альцгеймера

Болезнь Альцгеймера. Молекулярно-биологический аспект. Часть II

Болезнь Альцгеймера. Молекулярно-биологический аспект. Часть I

Болезнь Альцгеймера. От описания симптомов - к молекулярным механизмам.

Главный комплекс тканевой совместимости человека (HLA). Часть 5

Главный комплекс тканевой совместимости человека (HLA). Часть 3

Главный комплекс тканевой совместимости человека (HLA). Часть 2

Главный комплекс тканевой совместимости человека (HLA). Часть 1

«Страшная» еда

Эглин

Почему философия не удовлетворяет биолога?

Инвестиционная привлекательность Российского рынка биоинформатики и биотехнологий

Геносистематика - что это такое.

Эндотоксины Bacillus thuringiensis

Диабет. (часть II)

Вешенка и человек

Диабет. (часть I)

Почему ограничены размеры бактериальной колонии?

Функциональная роль остеопонтина в развитии и реконструкции костной ткани.

Структура и некоторые свойства белка остеопонтина.

Проблемы инвестирования в биотехнологические разработки для сельского хозяйства.

Роль метилирования ДНК в канцерогенезе.

Жизнь и смерть овечки Долли

Дню борьбы с проказой посвящается...

Бактерии, приносящие миллиард.

Дню борьбы со СПИДом - достойные проводы!

Современная лаборатория молекулярной биологии.

Интервью с вампирчиком.


Наши статьи



Инсулин
Часть II.
Микробиологическое получение инсулина.


В предыдущей статье были рассмотрены биологические и физико-химические свойства инсулина, а также его биосинтез в организме человека. Как уже говорилось выше, на данный момент существует потребность в производстве этого гормона в достаточных количествах. В данной статье мы рассмотрим методы получения инсулина человека по мере их разработки (в хронологическом порядке).

1. Способы получения инсулина человека.

Исторически первым способом получения инсулина для терапевтических целей является выделение аналогов этого гормона из природных источников (островков поджелудочной железы крупного рогатого скота и свиней). В 20-х годах прошлого века было установлено, что бычий и свиной инсулины (которые являются наиболее близкими к инсулину человека по своему строению и аминокислотной последовательности) проявляют в организме человека активность, сравнимую с инсулином человека. После этого долгое время для лечения пациентов, страдающих сахарным диабетом I типа, применяли инсулины быка или свиньи. Однако через некоторое время было показано, что в ряде случаев в организме человека начинают накапливаться антитела к бычьему и свиному инсулинам, тем самым сводя на нет их действие.

С другой стороны, одним из преимуществ этого метода получения инсулина является доступность исходного сырья (бычий и свиной инсулин можно легко получать в больших количествах), что и сыграло решающую роль при разработке первого способа получения инсулина человека. Этот метод получил название полусинтетического.

При этом способе получения инсулина человека в качестве исходного сырья использовали свиной инсулин. От очищенного свиного инсулина отщепляли С-концевой октапептид В-цепи, после чего синтезировали С-концевой октапептид человеческого инсулина. Затем его химически присоединяли, снимали защитные группы и очищали полученный инсулин. При тестировании данного метода получения инсулина было показана полная идентичность полученного гормона инсулину человека. Основной недостаток данного способа заключается в высокой стоимости получающегося инсулина (даже сейчас химический синтез октапептида - дорогое удовольствие, тем более в промышленном масштабе).

В настоящее время инсулин человека, в основном, получают двумя способами [2]: модификацией свиного инсулина синтетико-ферментативным методом [1] и генно-инженерным способом [3]. В первом случае метод основан на том, что свиной инсулин отличается от инсулина человека одной заменой на С-конце В-цепи Ala30Thr. Замену аланина на треонин осуществляют путем катализируемого ферментом отщепления аланина и присоединение вместо него защищенного по карбоксильной группе остатка треонина, присутствующего в реакционной смеси в большом избытке. После отщепления защитной О-трет-бутильной группы получают инсулин человека [1].

Как уже упоминалось выше (см. статью "Инсулин", Часть I.), инсулин оказался первым белком, полученным для коммерческих целей с использованием технологии рекомбинантной ДНК. Существует два основных подхода для получения генно-инженерного инсулина человека. В первом случае осуществляют раздельное (разные штаммы-продуценты) получение обеих цепей с последующим фолдингом молекулы (образование дисульфидных мостиков) и разделением изоформ. Во втором - получение в виде предшественника (проинсулина) с последующим ферментативным расщеплением трипсином и карбоксипептидазой В [4, 5] до активной формы гормона. Наиболее предпочтительным в настоящее время является получение инсулина в виде предшественника, обеспечивающее правильность замыкания дисульфидных мостиков (в случае раздельного получения цепей проводят последовательные циклы денатурации, разделения изоформ и ренатурации).

При обоих подходах возможно как индивидуальное получение исходных компонентов (А- и В-цепи или проинсулин), так и в составе гибридных белков. Помимо А- и В-цепи или проинсулина, в составе гибридных белков могут присутствовать:

  • белок носитель - обеспечивающий транспортировку гибридного белка в периплазматическое пространство клетки или культуральную среду;
  • аффинный компонент - существенно облегчающий выделение гибридного белка.

    При этом оба эти компонента могут одновременно присутствовать в составе гибридного белка. Кроме этого, при создании гибридных белков может использоваться принцип мультимерности, (то есть, в гибридном белке присутствует несколько копий целевого полипептида), позволяющий существенно повысить выход целевого продукта.

    2 Экспрессия проинсулина в клетках Е.coli..

    В работе [6] авторы использовали штамм JM 109 N1864 со встроенной в плазмиду нуклеотидной последовательностью, экспрессирующей гибридный белок, который состоит из линейного проинсулина и присоединенного к его N-концу через остаток метионина фрагмента белка А Staphylococcus aureus. Культивирование насыщенной биомассы клеток рекомбинантного штамма обеспечивает начало производства гибридного белка, выделение и последовательная трансформация которого in tube приводят к инсулину. Другая группа исследователей [3] получала в бактериальной системе экспрессии слитой рекомбинантный белок, состоящий из проинсулина человека и присоединенного к нему через остаток метионина полигистидинового "хвоста". Его выделяли, используя хелатную хроматографию на колонках с Ni-агарозой [7] из телец включения и расщепляли бромцианом. Авторы определили, что выделенный белок является S-сульфонированным. Картирование и масс-спектрометрический анализ полученного проинсулина, очищенного ионнообменной хроматографией на анионите и ОФ (обращеннофазовой) ВЭЖХ (высокоэффективной жидкостной хроматографией), показали наличие дисульфидных мостиков, соответствующих дисульфидным мостикам нативного проинсулина человека. В работе [8] сообщается о разработке нового, усовершенствованного способа получения инсулина человека методами генной инженерии в прокариотических клетках. Авторами установлено, что полученный инсулин по своему строению и биологической активности идентичен гормону, выделенному из поджелудочной железы.

    В последнее время пристальное внимание уделяется упрощению процедуры получения рекомбинантного инсулина методами генной инженерии. Так в работе [9] авторы получили слитой белок, состоящий из лидерного пептида интерлейкина 2 присоединенного к N-концу проинсулина, через остаток лизина. Белок эффективно экспрессировался и локализовался в тельцах включения. После выделения белок расщеплялся трипсином с получением инсулина и С-пептида. Другая группа исследователей [10] действовала аналогичным способом. Слитой белок, состоящий из проинсулина и двух синтетических доменов белка А стафилококков, связывающих IgG, локализовался в тельцах включения, но обладал более высоким уровнем экспрессии. Белок выделялся аффинной хроматографией с использованием IgG и обрабатывался трипсином и карбоксипептидазой В. Полученные инсулин и С-пептид очищались ОФ ВЭЖХ. При создании слитых конструкций весьма существенным является соотношение масс белка носителя и целевого полипептида. Так в работе [11] описано конструирование слитых конструкций, где в качестве полипептида- носителя использовали белок, связывающий сывороточный альбумин человека. К нему присоединяли один, три и семь С-пептидов. С-пептиды соединялись по принципу "голова-хвост" с помощью аминокислотных спейсеров, несущих сайт рестрикции Sfi I и два остатка аргинина в начале и в конце спейсера для последующего расщепления белка трипсином. ВЭЖХ продуктов расщепления показала, что отщепление С-пептида проходит количественно, а это позволяет использовать способ мультимерных синтетических генов для получения целевых полипептидов в промышленном масштабе.

    В работе [12] описано получение мутанта проинсулина, который содержал замену Arg32Tyr. При совместном расщеплении этого белка трипсином и карбоксипептидазой В образовывался нативный инсулин и С-пептид содержащий остаток тирозина. Последний, после мечения 125I, активно используется в радиоиммунном анализе. 3 Очистка инсулина.

    Инсулин, предназначенный для изготовления лекарственных препаратов, должен быть высокой чистоты. Поэтому необходим высокоэффективный контроль за чистотой получаемых продуктов на каждой стадии производства. Ранее с помощью ОФ и ИО (ионообменной) ВЭЖХ были охарактеризованы проинсулин-S-сульфонат, проинсулин, отдельные А- и В-цепи и их S-сульфонаты [13]. Также особое внимание уделяется флуоресцентным производным инсулина [14]. В работе [6] авторы исследовали применимость и информативность хроматографических методов при анализе продуктов всех стадий производства инсулина человека и составили регламент хроматографических операций позволяющий эффективно разделять и охарактеризовывать полученные продукты. Авторы [15] разделяли производные инсулина используя бифункциональные сорбенты (гидрофобная и ионообменная ОФ ВЭЖХ) и показали возможность управления селективностью разделения путем варьирования вклада каждого из взаимодействий, благодаря чему достигается большая эффективность при разделении близких аналогов белка. Кроме того, разрабатываются подходы для автоматизации и ускорения процессов определения чистоты и количества инсулина. В работе [16] сообщается об исследованиях возможности применения ОФ жидкостной хроматографии с электрохимическим детектированием для определения инсулина и разработана методика [17] определения инсулина, выделенного из островка Лангерганса методом иммуноаффинной хроматографии со спектрометрическим детектированием. В работе [18] исследовали возможность применения быстрого микроопределения инсулина с использованием капиллярного электрофореза с лазерно-флуоресцентным детектированием. Анализ выполняется путем добавления к пробе известного количества инсулина, меченного фенилизотиоцианатом (ФИТЦ) и фрагмента Fab моноклональных антител на инсулин. Меченый и обычный инсулины конкурентно вступают в реакцию образования комплекса с Fab. Меченый ФИТЦ инсулин и его комплекс с Fab разделяют за 30 секунд.

    В последнее время большое количество работ посвящено усовершенствованию способов получения инсулина, а также созданию лекарственных форм на его основе. Например, в США запатентованы гепатоспецифические аналоги инсулина [19], структурно отличающиеся от природного гормона за счет введения в положения 13 - 15 и 19 А-цепи и в положение 16 В-цепи иных аминокислотных остатков. Полученные аналоги используются в составе различных парентеральных (внутривенных, внутримышечных, подкожных), интраназальных лекарственных форм или имплантации в виде специальных капсул при лечении сахарного диабета. Особо актуальным является создание лекарственных форм вводящихся без инъекций. В работе [20] сообщается о создании макромолекулярной системы перорального применения , представляющей собой инсулин иммобилизованный в объеме полимерного гидрогеля, модифицированного ингибиторами протеолитических ферментов. Эффективность такого препарата составляет 70-80 % от эффективности подкожно введенного нативного инсулина. В другой работе [21] лекарственный препарат получают одноэтапной инкубацией инсулина с эритроцитами, взятыми в соотношении 1-4:100, в присутствии связывающего агента. Авторы сообщают о получении лекарственного препарата с активностью 1000 ед./г., полном сохранении активности при пероральном введении и хранении в течение нескольких лет в лиофилизированном виде.

    Кроме создания новых лекарственных препаратов и лекарственных форм на основе инсулина, разрабатываются новые подходы к решению проблемы сахарного диабета. Так, авторы работы [22] трансфицировали кДНК белка-переносчика глюкозы GLUT2 предварительно стабильно трансфицированные полноразмерной кДНК инсулина клетки НЕР G2 ins. В полученных клонах НЕР G2 Insgl глюкоза стимулирует близкую к нормальной секрецию инсулина и потенцирует секреторный ответ на другие стимуляторы секреции. При иммуноэлектронной микроскопии в клетках обнаружены содержащие инсулин гранулы, морфологически сходные с гранулами в b-клетках островков Лангерганса. В настоящий момент серьезно обсуждается возможность применения для лечения сахарного диабета 1 типа "искусственной b-клетки", полученной методами генной инженерии.

    Наряду с решением практических проблем изучаются и механизмы действия инсулина, а также структурно-функциональные отношения в молекуле. Одним из способов исследования является создание различных производных инсулина и изучение их физико-химических и иммунологических свойств [23, 24]. Как уже говорилось выше, ряд методов производства инсулина основан на получении данного гормона в виде предшественника (проинсулина) с последующим ферментативным расщеплением до инсулина и С-пептида. В настоящее время для С-пептида показано наличие биологической активности, что позволяет использовать его в терапевтических целях наряду с инсулином. В следующих статьях этой серии будут рассмотрены физико-химические и биологические свойства С-пептида, а также методы его получения.

    Автор статьи: Воюшин К. Е.


    Список цитируемой литературы:

    1. Молекулярная биология. Структура и функции белков./ Степанов В. М.// Москва, Высшая школа, 1996.

    2. Биоорганическая химия./ Овчинников Ю. А.// Москва, Просвещение, 1987.

    3. Протеолиз проинсулина человека, катализируемый нативным, модифицированным и иммобилизованным трипсином. / Миргородская О.А., Казанина Г.А., Миргородская Е.П., Шевченко А.А., Мальцев К.В., Мирошников А.И., Ройпсторфф П. // Биоорганическая Химия, 1997 - 23, № 2 стр. 91 - 97.

    4. Иммобилизация трипсина и карбоксипептидазы В на модифицированных кремнеземах и их применение в превращении рекомбинантного проинсулина человека в инсулин. / Кудрявцева Н.Е., Жигис Л.С., Зубов В.П., Вульфсон А.И., Мальцев К.В., Румш Л.Д. // Хим.-фармац. ж., 1995 - 29, № 1 стр. 61 - 64.

    5. Генно-инженерный инсулин человека. ВЭЖХ в анализе продуктов основных стадий производства./ Клюшниченко В. Е., Акимов С. А., Мальцев К. В., Арутюнян А. М., Иванов А. Е., Вульфсон А. Н.// Биорганическая химия, 1992 - 18, № 12 стр. 1478-1486.

    6. Expression, purification and characterization of recombinant human proinsulin. / Cowley D. J., Mackin R. B. // FEBS Lett., 1997 - 402, № 2-3 стр. 124 - 130.

    7. Fusion tails for the recovery and purification of recombinant proteins. / Ford C.F., Suominen I., Glatz C.E. // Protein Expr. Purif., 1991 - 2, № 2-3, стp. 95-107.

    8. Generation of human insulin: Заявка WO 96/20724 междунар. РСТ, МКИ6 A61K 38/28, C12N 15/17 / Hartman J., Mendelovitz S., Goresku M., Bio-Technology General Corp. - № 94/13268; Заявл 29.12.94; Опубл 11.7.96.

    9. Expression and folding of an interleukin-2-proinsulin fusion protein and its conversion into insulin by a single step enzymatic removal of the C-peptide and the N-terminal fused sequence. / Castellanos-Serra L.R., Hardy E., Ubieta R., Vispo N.S., Fernandez C., Besada V., Falcon V., Gonzalez M., Santos A., Perez G., Silva A., Herrera L. // FEBS Lett., 1996 - 378, № 2 стр. 171 - 176.

    10. Integrated production of human insulin and its C-peptide. / Nilsson J., Jonasson P., Samuelsson E., Stahl S., Uhlen M. // J. Biotechnol., 1996 - 48, № 3 стр. 241 - 250.

    11. Gene fragment polimerization gives increased yields of recombinant human proinsulin C-peptide. / Jonasson P., Nygren P.A., Johansson B.L., Wahren J., Uhlen M., Stahl S. // Gene, 1998 - 210, № 2 стр. 203 - 210.

    12. Preparation of Tyr-C-peptide from genetically altered human insulin precurssor. / Sun H., Tang J., Hu M. // Appl. Biochem. Biotechnol., 1995 - 55, № 3 стр. 167 - 174.

    13. Coordinative interactions in the separetion of insulin and its derivatives by high-performans liquid chromatography./ Peter A., Szepesi G., Balaspiri L., Burger K.// J. Chromatogr., 1987 - 408 стр. 43-52.

    14. Высокоэффективная жидкостная хроматография флюоресцентных производных инсулина. / Петроченко Е.В., Кисилев П.А. // Биоорганическая Химия, 1996 - 22, № 3 стр. 175 - 179.

    15. Генно-инженерный инсулин человека. Повышение эффективности хроматографического разделения при использовании принципа бифункциональности. / Романчиков А.Б., Якимов С.А., Клюшниченко В.Е., Арутунян А.М., Вульфсон А.Н. // Биоограническая Химия, 1997 - 23, № 2 стр 98 - 103.

    16. Determination of insulin and other secretory products from islet of langerhans using liquid cromatography coupled with electrochemical detection. / Shen H., Huang L., Kennedy R. T. // Pittsburgh Conf. [Anal. Chem. and Apll. Spectrosc.] presents PITTCON'95, New Orleans, La, March 5-10, 1995: Book Abstr. - [New Orleans, (La)], 1995 стр. 481.

    17. Dual microcolumn immunoaffinity liquid chromatography of insulin. / Shen H., Aspinwall C. A., Kennedy R. T. // Pittsburgh Conf. [Anal. Chem. and Apll. Spectrosc.] presents PITTCON'96, Chicago, III, March 3-8, 1996: Book Abstr. - [Chicago, (III)], 1996 стр. 867.

    18. Competitive immunoassay for insulin using capillary electrophoresis. / Tao L., Shultz N. M., Kennedy R. T. // Pittsburgh Conf. [Anal. Chem. and Apll. Spectrosc.] presents PITTCON'95, New Orleans, La, March 5-10, 1995: Book Abstr. - [New Orleans, (La)], 1995 стр. 10.

    19. Hepatospecific insulin analoques. : Пат 5208217 США, МКИ5 А61К 37/26, С07К 7/40 / Katsoyannis P.G., Mount Sinai School of Medicine of the city University of New York - № 785146; Заявл. 29.10.91; Опубл. 04.05.93; НКИ 514/3.

    20. Макромолекулярные системы с инсулином в связи с проблемой диабета. / Плате Н.А., Валуев Л.И., Старосельцева Л.К., Валуева Т.А., Ульянова М.В., Валуев И.Л., Сытов Т.А., Аметов А.С., Княжев В.А. // Высокомолек. соед. А - Б, 1994 - 36, № 11 стр. 1876 - 1879.

    21. Способ получения препарата инсулина для перрорального применения : Пат 2058788 Россия, МКИ6 А61К 38/28, 9/14 Моренкова С. А. - № 5000106/14 Заявл. 26.7.91; Опубл. 27.4.96, Бюл. № 12.

    22. Gen therapy of diabetes: Glucose-stimulated insulin secretion in a human hepatoma cell line (HEP G2 Inslg). / Simpson A. M., Marshall G. M., Tuch B. E., Maxwell L., Szymanska B., Tu J., Beynon S., Swan M. A., Comacho M. // Gene Ther., 1997 - 4, № 11 стр. 1202 - 1215.

    23. Синтез фрагментов инсулина и изучение их физико-химических и иммунологических свойств. / Панин Л.Е., Тузиков Ф.В., Потеряева О.Н., Максютов А.З., Тузикова Н.А., Сабиров А.Н. // Биоорганическая Химия, 1997 - 23, № 12 стр. 953 - 960.

    24. Аналоги проинсулина человека. Получение делеции в участке гена проинсулина, кодирующего область связывания с рецептором. / Гурьев С.О., Тялина Ю.Ю., Траханова М.Н., Яроцкий С.В. // Антибиотики и Химиотерапия, 1994 - 39, № 4 стр 3 -7.


  • Rusbiotech™
    Copyright © 2000-2003 Rusbiotech
    designed by Интерруссофт © 2003