На главную ДЛЯ НОВИЧКОВДЛЯ НОВИЧКОВ СОБЫТИЯ КАРТА САЙТА ПРЕСС-СЛУЖБА
ДЛЯ СПЕЦИАЛИСТОВДЛЯ СПЕЦИАЛИСТОВ ДАТЫ ПОЛЕЗНЫЕ ССЫЛКИ О ПРОЕКТЕ
ДЛЯ ИНВЕСТОРОВДЛЯ ИНВЕСТОРОВ КОМПАНИИ ГОСТЕВАЯ НАГРАДЫ
SWITCH TO ENGLISH СТАТЬИСТАТЬИ БАЗА ДАННЫХ ФОРУМ КОНТАКТЫ
поиск по сайту  
подписка  


Биотерроризм

Биокомпьютеры

С-пептид. Часть III.

С-пептид. Часть II

С-пептид. Часть I.

Инсулин. Часть II.

Инсулин. Часть I.

Атипичная пневмония. Часть II.

Атипичная пневмония. Часть I.

Геносистематика - что это такое Часть 2.

ДНК или РНК: кто более матери-Природе ценен?

Будущее коммерческого внедрения генетически модифицированных организмов в странах европейского союза

Простая модель реакции организма на внешние воздействия

Некоторые современные подходы к терапии болезни Альцгеймера

Болезнь Альцгеймера. Молекулярно-биологический аспект. Часть II

Болезнь Альцгеймера. Молекулярно-биологический аспект. Часть I

Болезнь Альцгеймера. От описания симптомов - к молекулярным механизмам.

Главный комплекс тканевой совместимости человека (HLA). Часть 5

Главный комплекс тканевой совместимости человека (HLA). Часть 3

Главный комплекс тканевой совместимости человека (HLA). Часть 2

Главный комплекс тканевой совместимости человека (HLA). Часть 1

«Страшная» еда

Эглин

Почему философия не удовлетворяет биолога?

Инвестиционная привлекательность Российского рынка биоинформатики и биотехнологий

Геносистематика - что это такое.

Эндотоксины Bacillus thuringiensis

Диабет. (часть II)

Вешенка и человек

Диабет. (часть I)

Почему ограничены размеры бактериальной колонии?

Функциональная роль остеопонтина в развитии и реконструкции костной ткани.

Структура и некоторые свойства белка остеопонтина.

Проблемы инвестирования в биотехнологические разработки для сельского хозяйства.

Роль метилирования ДНК в канцерогенезе.

Жизнь и смерть овечки Долли

Дню борьбы с проказой посвящается...

Бактерии, приносящие миллиард.

Дню борьбы со СПИДом - достойные проводы!

Современная лаборатория молекулярной биологии.

Интервью с вампирчиком.


Наши статьи


Эндотоксины Bacillus thuringiensis.

Bacillus thuringiensis - энтомопатогенный аэробный почвенный грамположительный микроорганизм, обладающий способностью в ходе споруляции образовывать кристаллоподобные включения, состоящие из энтомоцидных белков - дельта-эндотоксинов (также называемых Cry-белками). Кристаллы имеют бипирамидальную, кубическую или округлую форму и расположены в спорангии на противоположном по отношению к споре конце клетки.

В настоящее время описано более 60 подвидов Bacillus thuringiensis. Продуцируемые ими токсины различаются по специфичности энтомоцидного действия. Известны токсины, с высокой специфичностью убивающие отдельных представителей отрядов Lepidoptera (семейства Cry1 и Cry9), Coleoptera (семейство Cry3) и Diptera (семейства Cry4 и Cry11) на стадии личинки. Эндотоксины Cry2 обладают двойной специфичностью - для Lepidoptera и Diptera.

Большинство энтомоцидных белков имеют молекулярную массу 130-145 kDa (представители семейств Cry1, Cry4, Cry9 и др.). Попадая в кишечник насекомых, они подвергаются действию присутствующих там протеиназ, образуя устойчивые к дальнейшему протеолизу фрагменты 60-70 kDa - так называемые "истинные токсины". Для этих белков показана четко выраженная доменная структура. С-концевой район достаточно консервативен среди разных классов энтомоцидных белков. При протеолизе он легко деградирует путём отщепления небольших фрагментов с молекулярной массой 15-35 kDa, в свою очередь быстро подвергающихся дальнейшему гидролизу. N-концевой район (соответствующий "истинному токсину") относительно устойчив к протеолизу и гораздо более вариабелен у разных белков, нежели С-концевой район. Таким образом, исходные 130-145 kDa белки представляют собой протоксины, нуждающиеся в активации протеиназами кишечного сока насекомых.

Группа токсинов, к которой принадлежат представители семейств Cry2, Cry3, Cry10 и Cry11, включает в себя белки с молекулярной массой 60-70 kDa. По первичной структуре они напоминают N-концевые участки ("истинные токсины") 130-145 kDa белков.


Доменная организация эндотоксинов.

Методом рентгеноструктурного анализа третичная структура определена для двух энтомоцидных белков: дельта-эндотоксина Cry3Aа (67kDa), продуцируемого ssp. tenebrionis и "истинного токсина", соответствующего протоксину Cry1Aa (65kDa, ssp. kurstaki) (Groshulski, et al, 1995). Притом, что идентичность этих белков по аминокислотной последовательности составляет лишь 33%, их третичные структуры сходны. Выравнивание первичной структуры других эндотоксинов и расчет предполагаемой вторичной структуры позволяют предположить, что все они имеют принципиально сходную укладку полипептидной цепи.

Третичная структура молекулы "истинных токсинов" представлена тремя доменами (рис. 1).


Рисунок 1. Третичная структура токсина Cry1aa.

Первый, N-концевой, построен из семи a-спиралей, при этом преимущественно гидрофобная пятая a-спираль окружена шестью амфифильными так, что гидрофобные поверхности последних повернуты к a5. Спирали a3 - a7 имеют достаточную длину (5-9 полных оборотов, более 30 А), чтобы пронизать бислойную клеточную мембрану. Наиболее длинная (45 А) спираль a6 содержит 9 полных оборотов (Grochulski et al., 1995).

Второй домен состоит из трех b-листов, сомкнутых так, что в сечении получается треугольник. Два первых b-листа состоят из четырех антипараллельных складок; третий - из трех b-складок и одной небольшой a-спирали (a8). В составе каждого b-листа между двумя внутренними нитями образуется петля. Эти петли собраны относительно близко друг к другу на вершине молекулы.

Третий домен представляет собой "сэндвич" из двух антипараллельных b-листов.

Несмотря на четко выраженную доменную структуру, в ходе денатурации молекула эндотоксина ведет себя как единое целое (Orth, et al, 1995). Эта целостность обеспечивается тесными междоменными контактами.

Наиболее сильные контакты обнаружены между первым и вторым доменами (площадь, занятая контактами составляет 1930 А2), несколько меньшая площадь контакта между доменами I и III (1180 A2). Во взаимодействиях этих доменов большую роль играют водородные связи и солевые мостики. Второй и третий домены контактируют достаточно небольшой поверхностью (910А2), и их связь обусловлена, в основном, гидрофобными взаимодействиями (Grochulski, et al.,1995).


Механизм действия эндотоксинов Bacillus thuringiensis.

При попадании в кишечник насекомого белковый кристалл растворяется в щелочной среде кишечного сока (рН 9.5-10.5); растворенные протоксины активируются протеолитическими трипсино- и химотрипсиноподобными ферментами кишечника до "истинных токсинов" (рис.2).


Рисунок 2. Механизм действия Cry-токсинов.
(a)- кристалл попадает в кишечник насекомого и растворяется; (b) - белок подвергается ферментативному гидролизу, образуется "истинный токсин"; (с) - II и III домены взаимодействуют с мембранным белком - рецептором; (d) - изменяется конформация I-го домена; (e) - несколько молекул токсина образуют в мембране пору или ионный канал.

Следующей стадией токсического воздействия является связывание "истинного токсина" с аффинным к нему белком (рецептором), экспонированным на поверхности апикальных мембран эпителиальных клеток кишечника. Связывание токсина с рецептором является обратимым (Hofmann, et al., 1986; Hofmann, et al., 1988).

На следующей стадии происходит необходимая перестройка конформации молекулы токсина с последующим внедрением некоторых из формирующих её структур в мембранный бислой. После этого связывание токсина с мембраной становится необратимым (Ihara, et al., 1993). Необходимость внедрения a-спиралей первого домена в мембрану чувствительной клетки для того, чтобы связывание стало необратимым, доказывается тем, что неполноценная молекула токсина, состоящая только из II-го и III-его доменов, связывается с мембраной только обратимо.

По всей видимости, одновременно с внедрением в мембрану происходит ассоциация нескольких молекул токсина (Masson et al,1999). Ансамбль трансмембранных участков, принадлежащих нескольким ассоциированным молекулам токсина, образует (в зависимости от конкретной пары токсин/мембрана) пору, или ионный канал. В первом случае (образование поры), происходит гибель клеток по механизму коллоидно-осмотического лизиса. Во втором, (образование ионного канала) - вследствие резкого изменения ионного состава и рН внутриклеточной среды.

Одним из методических подходов к изучению функциональной роли альфа-спиралей является синтез пептидов, идентичных по аминокислотному составу изучаемой спирали.

Синтетические пептиды, соответствующие пятой a-спирали I-го домена Сry1Ac и Cry3A способны образовывать каналы в фосфолипидных мембранах, и вызывать гемолиз эритроцитов. Видимо, гидрофобная спираль a5 обладает высоким сродством к фосфолипидным мембранам.

Иностранные авторы изучили взаимодействие между спиралями a-5 и a-7 в ходе их воздействия на мембрану. Они показали, что спираль a7 сама по себе не образует поры или канала, однако при совместном действии двух пептидов, соответствующих a-5 и a-7, канал в искусственных фосфолипидных мембранах образуется значительно эффективнее, чем при действии отдельного пептида, соответствующего a-5. Авторами работы этой предложена следующая модель (так называемая "модель зонтика") взаимодействия этих спиралей и образования поры в мембране клетки-мишени. После связывания второго домена с рецептором a7 оказывается наиболее приближенной к мембране, узнает ее и взаимодействует с липидным бислоем, являясь своего рода сенсором связывания. Затем пятая a-спираль, обладающая аффинностью к a7, приближается к лежащей на мембране седьмой спирали и пронизывает фосфолипидный бислой. Несколько молекул токсина собираются вместе так, что их пятые a-спирали выстилают пору, а седьмые лежат на поверхности мембраны, как спицы зонтика.

Подобную, но несколько отличающуюся модель предлагают для токсина Cry1Aa в своей работе Masson с соавторами. Согласно предполагаемой ими гипотезы, внутренность ионного канала выстилают четвертые альфа-спирали олигомера, состоящего из четырех молекул токсина. При этом ключевую роль в ион-транспортной активности канала, по мнению авторов, играет Asp136, находящийся внутри канала.

Также в этой работе рассмотрено участие в олигомеризации участков первого домена молекулы. По данным авторов, в объединении четырех молекул токсинов помимо второг и третьего домена играют существенную роль третья и шестая альфа-спирали первого домена. Согласно предложенной схеме, они расположены над поверхностью мембраны чувствительной клетки таким образом, что a6 одной молекулы токсина взаимодействует с a3 соседнего белка (Masson et al, 1999)(рис. 3).


Рисунок 3. Схема ионного канала.

Другой гипотетический механизм образования поры в мембранах клеток - мишеней заключается в следующем. После взаимодействия воображаемых поверхностей, сформированных петлями второго домена, с рецептором, второй домен претерпевает определенные конформационные изменения, которые передаются на пару спиралей первого домена, скорее всего, a6 - a7, наиболее тесно взаимодействующих со вторым доменом. В результате передачи конформационного напряжения на первый домен, петли и шпильки, соединяющие a-спирали и расположенные ближе к мембране клетки-мишени, входят в липидный бислой. Это, в свою очередь, вызывает некоторые повреждения мембраны и следующую группу конформационных изменений первого домена, в результате которых его a-спирали, в первую очередь a5, пронзают мембрану и образуют пору. (Li, et al., 1991).

автор статьи: Кролик


Cписок использованной литературы:

  1. Grochulski P., L. Masson, S. Borisova, M. Pusztai-Carey, J.-L. Schwartz, R. Brousseau, M. Cygler, Bacillus thuringiensis Cry1Aa insecticidal toxin: crystal structure and channel formation, Journal of Molecular Biology, 1995, 254: 447-464.
  2. Orth P., Zalunin I.A., Gasparov V.S., Chestukhina G.G., Stepanov V.M., 1995, Journal of Protein Chemistry, 1995, 14: 241-249.
  3. Hofmann C., P. Luthy, Binding and activity of Bacillus thuringiensis delta-endotoxin to invertebrate cells, 1986, Arch. Microbiology, 146: 7-11.
  4. Hofmann C., P. Luthy, R. Hutter, V. Pliska, Binding of the delta-endotoxin from Bacillus thuringiensis to brush-border membrane membrane vesicles of the cabbage butterfly (Pieris brassicae), 1988, European Journal of Biochemistry, 173: 85-91.
  5. Ihara H., E. Kuroda, A. Wadano, M. Himeno, Specific toxicity of d-endotoxins from Bacillus thuringiensis to Bombyx mori, 1993, Bioscience, Biotechnology, Biochemistry, 57: 200-204.
  6. Masson L, Tabashnik BE, Liu YB, Brousseau R, Schwartz JL., Helix 4 of the Bacillus thuringiensis Cry1Aa toxin lines the lumen of the ion channel, Journal of Biological Chemistyr 1999 Nov 5;274(45):31996-2000


Rusbiotech™
Copyright © 2000-2003 Rusbiotech
designed by Интерруссофт © 2003