На главную ДЛЯ НОВИЧКОВДЛЯ НОВИЧКОВ СОБЫТИЯ КАРТА САЙТА ПРЕСС-СЛУЖБА
ДЛЯ СПЕЦИАЛИСТОВДЛЯ СПЕЦИАЛИСТОВ ДАТЫ ПОЛЕЗНЫЕ ССЫЛКИ О ПРОЕКТЕ
ДЛЯ ИНВЕСТОРОВДЛЯ ИНВЕСТОРОВ КОМПАНИИ ГОСТЕВАЯ НАГРАДЫ
SWITCH TO ENGLISH СТАТЬИСТАТЬИ БАЗА ДАННЫХ ФОРУМ КОНТАКТЫ
поиск по сайту  
подписка  


Биотерроризм

Биокомпьютеры

С-пептид. Часть III.

С-пептид. Часть II

С-пептид. Часть I.

Инсулин. Часть II.

Инсулин. Часть I.

Атипичная пневмония. Часть II.

Атипичная пневмония. Часть I.

Геносистематика - что это такое Часть 2.

ДНК или РНК: кто более матери-Природе ценен?

Будущее коммерческого внедрения генетически модифицированных организмов в странах европейского союза

Простая модель реакции организма на внешние воздействия

Некоторые современные подходы к терапии болезни Альцгеймера

Болезнь Альцгеймера. Молекулярно-биологический аспект. Часть II

Болезнь Альцгеймера. Молекулярно-биологический аспект. Часть I

Болезнь Альцгеймера. От описания симптомов - к молекулярным механизмам.

Главный комплекс тканевой совместимости человека (HLA). Часть 5

Главный комплекс тканевой совместимости человека (HLA). Часть 3

Главный комплекс тканевой совместимости человека (HLA). Часть 2

Главный комплекс тканевой совместимости человека (HLA). Часть 1

«Страшная» еда

Эглин

Почему философия не удовлетворяет биолога?

Инвестиционная привлекательность Российского рынка биоинформатики и биотехнологий

Геносистематика - что это такое.

Эндотоксины Bacillus thuringiensis

Диабет. (часть II)

Вешенка и человек

Диабет. (часть I)

Почему ограничены размеры бактериальной колонии?

Функциональная роль остеопонтина в развитии и реконструкции костной ткани.

Структура и некоторые свойства белка остеопонтина.

Проблемы инвестирования в биотехнологические разработки для сельского хозяйства.

Роль метилирования ДНК в канцерогенезе.

Жизнь и смерть овечки Долли

Дню борьбы с проказой посвящается...

Бактерии, приносящие миллиард.

Дню борьбы со СПИДом - достойные проводы!

Современная лаборатория молекулярной биологии.

Интервью с вампирчиком.


Наши статьи


Эглин

Общая характеристика белка

В появившейся в 1977 г. работе Seemuller U. с соавторами [1] сообщалось о выделении двух ингибиторов белковой природы сходного аминокислотного состава, обладающих способностью ингибировать лейкоцитарную эластазу и химотрипсиноподобные протеиназы. Ингибиторы, названные авторами "эглинами", были выделены из экстракта пиявок Hirudo medicinalis посредством гель-фильтрации и ионообменной хроматографии на ДЕАЕ-целлюлозе. Конечное разделение эглинов на индивидуальные вещества (эглин В и эглин С) достигалось хроматографией на SP-Сефадексе. Первичная структура эглинов была определена в работах [2,3]. Они эффективно ингибируют a-химотрипсин из поджелудочной железы быка, химазу из легочной ткани свиньи, субтилизин из бактериальных источников, протеиназы нейтрофилов (лейкоцитарная эластаза человека и катепсин G из гранулоцитов человека) [1,4].


Рис 1. Третичная структура эглина С, полученная на основе изучения кристалла комплекса ингибитора с субтилизином Carlsberg. Указано положение a-углеродных атомов полипептидной цепи. Боковые цепи показаны для Thr44, Leu45, Asp46 связывающей петли и для Arg 51 и Arg53.

Эглин С представляет собой белок с молекулярной массой 8141.1 Da, содержит 70 аминокислотных остатков. Эглин В отличается от эглина С одной аминокислотной заменой тирозин в положении 35 заменен на гистидин (Tyr35His) [5]. Замена Tyr 35 His не связанна с активным центром ингибитора, поскольку оба эглина имеют неразличимые константы ингибирования по отношению к a-химотрипсину, субтилизину, лейкоцитарной эластазе и катепсину G [1].

Структура эглина не стабилизирована дисульфидными связями, однако, белок является высоко устойчивым к кислотной и термической денатурации. Эглины не подвергаются протеолизу трипсином без предварительной интенсивной обработки кислотами. Расщепление полипептидной цепи эглина требует нагрева до 70°С в 20% трифторуксусной кислоте в течении 1 часа. Даже после обработки кислотой (рН 2, 80°С, 10 мин.) не наблюдается снижения ингибирующей активности эглина С [5]. По своим свойствам эглин С аналогичен эндогенным ингибиторам протеиназ человека - a2-макроглобулину и a1-антитрипсину, служащим в норме для защиты нижних дыхательных путей от протеолитического действия эластазы из нейтрофилов [6]. По сравнению с эндогенным ингибитором лейкоцитарной эластазы a1PI, эглин С устойчив к окислению. На основании анализа аминокислотной последовательности, эглин С отнесен к семейству ингибитора 1 из картофеля (РI-1) по классификации ингибиторов сериновых протеиназ[7].

Строение эглина С

Использование методов рентгеноструктурного анализа позволило определить третичную структуру свободного эглина С [8] и структуру эглина С в комплексах с протеиназами, объяснить механизм ингибирующего действия эглина С. Исследования по ЯМР-спектроскопии эглина С позволили установить третичную структуру эглина С в растворе, показать наиболее подвижные, способные к конформационным переходам, участки полипептидной цепи эглина С.
Рис 2. Регулярные элементы вторичной структуры эглина С, полученные на основе исследования ингибитора методами ЯМР-спектроскопии. Стрелками обозначено взаимодействие протонов в b-листах белка.

Методом ЯМР-спектроскопии выявлено, что структура эглина С состоит из двух основных элементов: a-спиралей и состоящего из четырех тяжей нерегулярного b-складчатого слоя. Две спирали локализованы на участке, близком к N-концу молекулы эглина С.
Рис 3. Схема взаимодействия боковых цепей аминокислот связывающей цепи и гидрофобной сердцевины в эглине С. В стабилизации связывающей петли участвуют Arg51, Arg53, Arg48, Thr44, Asp46 и карбоксильная группа Gly70.

В эглине С гидрофобная сердцевина обладает большой стабильностью, а N-концевой гептапептид имеет неупорядоченную структуру. В связывающей, определяющей ингибирующее действие петле эглина С (G40 -R48) [9] отклонения боковых цепей составляют более 3.0 ангстрем, то есть, в растворе полипептидная цепь связывающей петли эглина С способна претерпевать конформационные изменения шарнирного типа [10].

Эти свойства эглина С, а также установленная на основе рентгеноструктурного анализа третичная структура полипептида [9] позволяют использовать его в качестве модельной системы при проведении работ в белковой инженерии (получение химерных белков на основе эглина). При этом достаточно устойчивая третичная структура эглина (как белка-носителя) должна обеспечить конформационное подобие нативному состоянию введенного полипептидного фрагмента. Изучение свойств полученных химерных полипептидов может способствовать выяснению структурно-функциональных отношений в белках.

Задача выбора области введения полипептидного фрагмента в состав полипептидной цепи эглина С во многом определяется наличием информации о третичной структуре последнего, полученной на основе рентгеноструктурного анализа [8]. Возможны два варианта включения линейного активного участка в состав химерного белка: либо замена близкого по первичной структуре фрагмента белка, либо вставка в экспонированные участки белковой молекулы. Известно, однако, что даже идентичные по первичной структуре пептиды могут принимать различную конформацию в разных белках [11]. Во втором случае активная последовательность не заменяет собой какой-либо фрагмент белка, а вставляется в экспонированные (петлевые или концевые) участки белковой молекулы. При этом предполагается, что локальные изменения в таких участках не должны существенно влиять на общую структуру белка и что вводимый функциональный фрагмент в силу своей экспонированности может принимать конформацию, необходимую для проявления биологической активности. Как указано выше, молекула эглина С обладает уникальной устойчивостью к термо- и кислотной денатурации. Это во многом определяется наличием в составе молекулы центрального участка, состоящего из нескольких b-тяжей. При этом функциональную роль в белке играет участок G40-R48, взаимодействующий с широким спектром сериновых протеиназ. N-концевые аминокислоты (T1-F10) не принимают участия в стабилизации молекулы в целом, являясь свободным архитектурным элементом.

Таким образом, пригодными для введения чужеродного полипептидного фрагмента участками белка являются места между Gly40-Tyr49 и в начале N-концевой части эглина С. Данная вариабельность мест введения чужеродного полипептидного фрагмента, а также высокая устойчивость самого эглина С делает этот белок не только удобной модельной системой, но и позволяет использовать его в качестве белка-носителя при микробиологическом производстве полипептидов биомедицинского назначения.

Фармакологические свойства

Результаты исследований показывают, что эглины могут быть эффективны in vivo против панкреатической и лейкоцитарной эластаз человека. Эглины блокируют воспалительные процессы, оказывают антисептическое действие. Благодаря им успешно лечатся гнойно-септические заболевания, посттравматические воспаления, заболевания печени, почек и желудочно-кишечного тракта, воспалительные процессы в желчном пузыре. По своим фармако-кинетическим характеристикам, а также вследствие селективности ингибирования и химической устойчивости, эглин С является перспективным препаратом для терапевтического применения при эмфиземе легких [12], предотвращении септического шока [13], травматического шока [14] и т.д. Вследствие пептидной природы и размеров молекулы, применение препаратов эглина С для животных и человека возможно внутривенно, интрахеально или местно.

Для подтверждения антиэластазной активности препарата in vivo широко применяются исследования на лабораторных животных с экспериментальной эмфиземой. Для эглина С было прямо показано, что препарат обладает антиэластазной активностью в опытах по предотвращению развития эмфиземы, вызванной введением эластазы у хомяков [12]. На основании измерения объема легких, морфометрических и морфологических исследований определено, что эглин С в дозах от 500 мкг полностью предотвращает развитие эмфиземы у лабораторных животных. Однако эффективное предотвращение эмфиземы требует значительно большего молярного избытка эглина С, чем в опытах in vitro. Это может быть следствием того, что при интрахеальном применении эглин С неравномерно распределяется в легких. Другая возможная причина заключается в том, что часть эглина инактивируется легочной тканью. С использованием меченного тритием эглина С проводили исследование распределения препарата в различных органах хомяков. Спустя четыре часа после интрахеального применения эглина С более 30% локализовалось в легких и бронхиальной жидкости.

Септический шок сопровождается притоком полиморфноядерных лейкоцитов в легкие и последующим высвобождением лизосомальных ферментов, которые усиливают воспалительную реакцию посредством специфической активации гуморальных систем или деградацией тканевых белков и факторов плазмы. Лизосомальные ферменты, к которым относится лейкоцитарная эластаза потенциально могут быть объектами воздействия ингибитор протеиназ при лечении патологических состояний. Показано[13], что защитный эффект эглина С при септическом шоке обусловлен, главным образом, ингибированием протеолиза белков плазмы и легочной ткани.

Исследования на животных показали, что Эглин С улучшает гемодинамический статус и увеличивает время жизни крыс с травматическим шоком. Травма вызывает значительное понижение артериального давления и уменьшение скорости сердечных сокращений у экспериментальных животных. Воздействие эглина С [14] вызывало устойчивое (на длительный срок) повышение артериального давления.

Фармакологическое действие эглина С, вероятно, не ограничивается эффектами, связанными только с ингибированием сериновых протеиназ. Так с использованием эглина С меченного тритием было показано, что эглин С обратимо связывается с поверхностью полиморфноядерных лейкоцитов человека. Каждая клетка содержит примерно 105 участков связывания эглина С с высокой аффинностью и, возможно, дополнительные участки связывания с низкой аффинностью. Причем в прямое взаимодействие эглина С с поверхностью лейкоцитов не вовлечены ни катепсин G, ни лейкоцитарная эластаза. Этот вывод был сделан на основании того, что связывание эглина С с лейкоцитами не подавляется другими ингибиторами сериновых протеиназ.

В настоящее время эглин С широко применяется в медицинской практике (экстренной хирургии и травматологии) во всем мире. Хотелось бы отметить, что в России группой научных сотрудников лаборатории Молекулярной биологии ГосНИИгенетики и селекции промышленных микроорганизмов под руководством доктора биологических наук В.П.Вейко был химически синтезирован ген эглина С, получен высокоэффективный штамм-продуцент эглина С и отработана методика его препаративного выделения [15].

Кандидат биологических наук И.Э. Лалаянц


Список цитируемой литературы:
  1. "Isolation and characterization of low molecular inhibitor (of chymotripsin and human granulocytic elastase and catepsin G) from leeches", Seemuller U., Meier M., Ohlsson K., Muller H.-P., Fritz H., Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem., 1977, vol 358, pp 1105-1117
  2. "Structure of elastase- catepsin G inhibitor of the leech Hirudo medicinales", Seemuller U., Eulitz M., Fritz H., Strobl A., Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem., 1980, vol 361, pp 1841-1846
  3. "Sequence determination of eglin C using combined microtechniques of amino acids analysis, peptide isolation, and automatic Edman degradation", Knecht R., Seemuller U., Liersch M., Fritz H., Braun D. G., Chang J.- Y., Anal. Biochem., 1983, vol 130, pp 65-71
  4. "Eglin/Elastase-catepsin G inhibitors from leeches", Seemuller U., Fritz H., Eulitz M., Methods Enzymol., 1981, vol 80, pp 804-816
  5. "Elastase-catepsin inhibitors eglin B and eglin C differ a single Tyr-His subtitution", Chang J.- Y., Knecht R., Maschler R., Seemuller U., Biol. Chem. Hoppe-Seyler, 1985, vol 366, pp 281-286
  6. Kalsheker N., Biosci. Rep., 1989, vol 9, pp 129-138
  7. "X-ray crystal structure of the serine proteinase inhibitor eglin C at 1.95 A resolution." Hipler K., Priestle J. P., Rahuel J., Grutter M. G., FEBS, 1992, vol 309, № 2, pp 139-145
  8. "Protein inhibitors of proteinase", Lasowski M., Kato I., Ann. Rev. Biochem., 1980, vol 49, pp 593-626
  9. "Refined 1.2 A crystal structure of the complex formed between subtilisin Carlsberg and the inhibitor eglin C. Molecular structure of eglin and its detailed interaction with subtilisin.", Bode W., Papamokos E., Musil D., Seemuller U., Fritz H., The EMBO Journal, 1986, vol 5, № 4, pp 813-818
  10. "The solution structure of eglin C based on measurements of many NOEs and coupling constants and its comparison with X-ray structures.", Hyberts S. G., Goldberg M. S., Havel T. F., Wagner G., Protein science, 1992, vol 1, № 6, pp 736-751
  11. "Analysis of sequence-similar pentapeptides in unrelated protein tertiary structures", P. Argos, J. Mol. Biol., 1987, vol 197, pp 331-348
  12. "A brief review of the biochemistry and farmacology of eglin C, an elastase inhibitor", Braun N. J., Schnebli H. P., Eur. J. Respir. Dis., 1986, vol 69, Suppl. 146, pp 541-547
  13. "Proteinase inhibitor therapy of severe infflamation in pigs: first results with eglin, a potent inhibitor of granulocytic elastase and catepsin G", Jochum M., Welter H. F., Siebeck M., Fritz H., in Pulmonary emphysema and proteolysis: 1986 (Taylor J. C. & Mittman C. eds.), 1987, pp 85-90, Academic Press. Inc.
  14. "Eglin C: an elastase/catepsin G inhibitors with therapeutic potential in emphysema and ARDS", Schnebli H. P., in Pulmonary emphysema and proteolysis: 1986 (Taylor J. C. & Mittman C. eds.), 1987, pp 73-84, Academic Press. Inc.
  15. "Химический синтез гена ингибитора протеиназ (эглин С) без использования Т4-ДНК-лигазы и его экспрессия в E. coli", Вейко В.П., Осипов А. С., Шехтер И. И., Буленков М. Т., Ратманова К. И., Гулько Л. Б., Чибискова Н. А., Эррайс Л. Л., Деревщикова Е. Б., Дебабов В. Г., Биоорганическая химия, 1995, том 21, № 5, с 354-358


Rusbiotech™
Copyright © 2000-2003 Rusbiotech
designed by Интерруссофт © 2003